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Indagini

Ottimizzazione di un protocollo per testare l’attività degli oli essenziali sul biofilm prodotto da agenti patogeni batterici dei pesci

of Di mercurio M. –Bugli F. –Sanguinrtti F. – Scarafile D. – Modesto M. – Bignami G. – Fioravanti M.L. – Scozzoli M. – Matterelli P. – Di Vito M.


La formazione di un biofilm è un evento potenzialmente pericoloso, con possibili implicazioni nelle epidemie, poiché costituisce un serbatoio di microrganismi patogeni. Le cellule microbiche possono aderire tra loro, alle cellule ospiti e alle superfici abiotiche, come vetro, polistirene e conchiglie, favorendo così la colonizzazione e la formazione del biofilm. Il biofilm è costituito da popolazioni batteriche ad elevata concentrazione, protette da una robusta matrice di esopolisaccaridi che permette una forte adesione alle superfici. La formazione di biofilm porta alla perdita di efficacia degli agenti antimicrobici, con una resistenza fino a 1000 volte maggiore nei loro confronti (Uruen et al., 2020). L’obiettivo principale per contrastare le infezioni da microrganismi patogeni nei pesci è l’individuazione di sostanze (possibilmente di origine naturale, ad esempio oli essenziali) che possano interferire con i biofilm patogeni. La fase iniziale di questo approccio coinvolge l’indagine di modelli in vitro di biofilm al fine di valutare l’efficacia degli agenti antibiofilm selezionati. Lo scopo del presente studio è stato l’ottimizzazione delle attuali tecniche utilizzate per la produzione di biofilm costituito da microrganismi patogeni dei pesci, per valutare l’efficacia di composti antibiofilm.

Materiali e metodi
Sono stati testati i seguenti microrganismi patogeni per i pesci: Yersinia ruckeri, Vibrio harveyi, Photobacterium damselae subsp. piscicida, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida, Pseudomonas anguilliseptica, Tenacibaculum maritimum. Ciascun microrganismo è stato coltivato su specifici substrati agarizzati e successivamente coltivato nel substrato Mueller Hinton.
Al fine di individuare il protocollo ottimale per esaminare l’efficacia degli oli essenziali sulla formazione del biofilm, è stata condotta una comparazione tra la crescita dei microrganismi con e senza l’aggiunta di carapaci sterilizzati ottenuti da gamberetti.
Questa valutazione è stata eseguita in piastre di polistirene da 24 pozzetti, in cui i batteri sono stati inoculati in una sospensione di 0.5 McFarland diluita 1:100. I microrganismi coltivati sia con che senza l’aggiunta di carapace sono stati sottoposti a test di sensibilità utilizzando una miscela commerciale di oli essenziali denominata MIX GL.

Risultati
Sono state evidenziate differenze nella formazione del biofilm tra i microrganismi saggiati. Yersinia ruckeri ha mostrato la migliore capacità di formare biofilm. Tutti i ceppi testati erano in grado di aderire alle piastre di polistirene e ai carapaci di gamberetti, ma vi erano notevoli differenze nella formazione del biofilm sviluppato in relazione alle superfici testate. Analizzando i carapaci di gamberetti, è stato osservato che il cristal violetto, composto di elezione per evidenziare la formazione del biofilm, non può essere utilizzato direttamente per misurare la formazione del biofilm, poiché i carapaci assorbono il cristal violetto anche in assenza di biofilm. Pertanto, il biofilm formato è stato valutato misurando la crescita dei microrganismi dopo averli staccati dalle diverse superfici (piastre di polistirene e carapaci di gamberetti). Il biofilm formato sul carapace era maggiore rispetto a quello cresciuto sul polistirene.
Questo risultato è molto importante perché un biofilm ottimale consente una corretta valutazione dell’efficacia delle sostanze antibiofilm. Come mostrato in Figura 1, al tempo iniziale il valore di densità ottica e quindi di crescita di Yersinia ruckeri era più alto nel campione in cui le cellule erano cresciute sul carapace, e questa differenza è stata mantenuta per tutte le curve di crescita. Le migliori performance delle cellule cresciute sul carapace sono accompagnate da una maggiore resistenza all’attività antibatterica degli oli essenziali (Figure 2 e 3).

Conclusioni
Il modello sperimentale descritto nel presente lavoro si è rivelato molto utile per valutare in modo ottimale l’attività antibiofilm e per identificare con precisione la dose efficace di oli essenziali, evitando l’uso di dosi inefficaci che potrebbero selezionare ceppi resistenti.


Mattia Di Mercurio*
Francesca Bugli
Maurizio Sanguinetti
Maura Di Vito
Dipartimento di Scienze Biotecnologiche di Base, Cliniche Intensivologiche e Perioperatorie
Università Cattolica del Sacro Cuore, Roma
Dipartimento di Scienze di Laboratorio e Infettivologiche
Fondazione Pol. Universitario A. Gemelli IRCCS, Roma
Donatella Scarafile
Monica Modesto
Paola Mattarelli
Dip. di Scienze della Vita Università di Modena e Reggio Emilia, Modena
Giorgia Bignami
Maria Letizia Fioravanti
Dip. di Scienze e Tecnologie Agroalimentari, Università di Bologna, Bologna
Maurizio Scozzoli
Dip. di Scienze Mediche Veterinarie, Università di Bologna, Ozzano Emilia (BO)


Bibliografia

FAO (2020), Lo stato della pesca e dell’acquacoltura nel mondo.
Uruen C., Chopo-Escuin G., Tommassen J., Mainar-Jaime R.C., Arenas J. (2020), Biofilm come promotori della resistenza e della tolleranza agli antibiotici batterici, Antibiotici (Basilea), 10(1):3, doi: 10.3390/antibiotici10010003.

Nota
* Società Italiana per la Ricerca sugli Oli Essenziali (SIROE), Roma; APA-CT Srl, Forlì.


PER LE FIGURE CONSULTARE LA VERSIONE CARTACEA



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